Tác dụng gián tiếp chống ung thư của nấm Linh chi đỏ thông qua các cytokine từ đại thực bào và tế bào lympho T

Dự Án Nghiên Cứu Này Được Hợp Tác Và Giúp Đỡ Bởi:

- Jer-Min Lin,Trường Dược, Trường Đại học Y Kaohsiung, Kaohsiung, Đài Loan
- Chun-Ching Lin, Khoa Dược, Trường Đại học Y Kaohsiung, Kaohsiung, Đài Loan
- Viện Nghiên cứu Y học Trung Quốc, Đài Bắc, Đài Loan
- Hui-Fen Chiu, Khoa Dược, Đại học Y Kaohsiung, Kaohsiung, Đài Loan
- Jenq-Jer Yang, Khoa Dược, Trường Đại học Y Kaohsiung, Kaohsiung, Đài Loan
- Viện khoa học y học, Đại học Tzu-Chi, Hualien, Đài Loan
- Phòng thí nghiệm Y học, Bệnh viện Phật giáo Từ Tế chung, Hualien, Đài Loan
- Khoa Sinh hóa, Đại học Yang-Ming, Đài Bắc, Đài Loan
- Sở Nghiên cứu Y học, Bệnh viện Đại học Quốc gia Đài Loan, Đài Bắc, Đài Loan

Mục đích của nghiên cứu này nhằm xác định tác dụng tăng cường hệ miễn dịch và chống ung thư của nấm Linh Chi Đỏ được trồng nhân tạo.

nam_linh_chi_viet_nam

Chất polysaccharides (PS) từ quả thể của Nấm Linh Chi Đỏ (PS-G) được phân lập và sử dụng để kích thích khả năng sản sinh cytokine của tế bào bạch cầu lympho T đơn nhân, và của đại thực bào. Kết quả của chúng tôi đã chỉ ra rằng tỉ lệ interleukin (IL)- 1 be-ta, thành phần diệt tế bào ung thư (TNF)-anpha, và IL- 6 trong đại thực bào được điều trị bằng PS- G (100 mg / ml) là 5.2, 9.8.

Tỉ lệ này cao hơn 29 lần so với nhóm không được điều trị. Ngoài ra, việc sản sinh interferon (IFN) - gamma từ tế bào lympho T cũng tăng mạnh khi có sự sự hiện diện của PS- G (25-100 mg / ml).

Hơn nữa, các cytokine chứa tế bào đơn nhân (PSG- MNC -CM) tác dụng phát hiện và ngăn chặn sự gia tăng tế bào mầm của cả hai dòng HL- 60 và U937. Phân tích DNA và xét nghiệm điện di cho thấy, điều trị bằng PSG - MNC -CM tạo ra một số lượng đáng kể tế bào bạch cầu apoptosis.

Phân tích dòng cytometric cho thấy số tế bào tự hủy ( 2,3+/-0,8% ) được kiểm soát, trong khi điều trị PSG- MNC–CM dẫn đến một sự gia tăng đáng kể mật độ tế bào apoptosis cả trong HL -60 (38,3 +/-4,5%) và trong các U937 (44,5z+/-3,8%). Ngoài ra, 40-45 % tế bào bạch cầu được kích hoạt để biệt hóa thành tế bào monocytic, thể hiện CD14 và kháng nguyên bề mặt CD68 .

Tuy vậy, riêng PS- G Nấm Linh Chi Đỏ sẽ không có tác dụng đó ngay cả khi dùng liều cao hơn 400 mg / ml. Khi đại thực bào không được điều trị và tế bào lympho T ít hoặc không sản sinh cytokine , các MNC -CM đã không ngăn chặn sự gia tăng tế bào bạch cầu, có nghĩa là hoạt động kháng u của PSG-MNC-CM được bắt nguồn từ các cytokine cấp cao. Nghiên cứu kháng thể trung hòa cũng cho thấy các cytokine kháng u trong PSG-MNC–CM chủ yếu từ TNF- anpha và IFN-gamma, có 2 cytokine hoạt động tương hỗ trong việc ức chếc chế tăng trưởng tế bào bạch cầu. Int . J. Ung thư 70:699-705, 1997 Wiley - Liss, Inc

Nấm Linh Chi Đỏ đã được sử dụng phổ biến như một phương thuốc để tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ ở Nhật và các nước Châu á khác. (Twan và cộng sự, 1996). Nấm Linh Chi Đỏ được xác định các tác dụng hiệu quả trong điều trị bệnh gan, bệnh cao huyết áp, bệnh tăng đường huyết mãn tính.

Nấm Linh Chi Đỏ tác dụng kháng u của hoạt chất polysaccharide. (Nakato và Kayo, 1989; Jane và cộng sự, 1987).

tac_dung_tich_cuc_va_tac_dung_phu_cua_nam_linh_chi

Thí nghiệm trên động vật, nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng hoạt chất polysaccharides thô và các hợp chất trong Nấm Linh Chi Đỏ (PS- G) có thể ngăn ngừa sự phát triển của ung thư mô S180 (Wang và cộng sự, 1991) đồng thời ức chế các tế bào di căn ở chuột (Twan và cộng sự , 1996).

Ngoài ra, một phần ethanol trong dung dịch chiết xuất của Nấm Linh Chi Đỏ (PS- G) đã cho thấy tác dụng gia tăng chu kỳ sống của những con chuột được cấy ghép khối u, cho dù dùng riêng PS_G hay kết hợp với thuốc kháng tế bào ung thư khác (Maugui và cộng sự, 1993)

Cơ chế về hoạt động kháng u của PS -G Nấm Linh Chi Đỏ là không rõ ràng. Một số nhà nghiên cứu đã cho rằng hoạt động kháng u của PS_G Nấm Linh Chi Đỏ có thể liên quan đến việc kích hoạt hoạt động miễn dịch (Wang và cộng sự, 1991)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp nuôi cấy in-vitro để phân tích những tác động của Nấm Linh Chi Đỏ lên chức năng của đại thực bào và tế bào lympho T, và lên sự phát triển của các tế bào bạch cầu. Kết quả của chúng tôi cho thấy tỉ lệ lớn cytokine được sản xuất bởi cả đại thực bào và tế bào lympho T đã gia tăng khi điều trị với Nấm Linh Chi Đỏ. Sự gia tăng của các tế bào bạch cầu không bị ảnh hưởng bởi riêng Nấm Linh Chi Đỏ, nhưng nó có tác dụng ức chế đáng kể do Nấm Linh Chi Đỏ kích hoạt các tế bào đơn nhân (PSG- MNC -CM) . Nghiên cứu trung hòa kháng thể cho thấy hoạt động kháng u của PSG- MNC -CM có nguồn gốc chủ yếu từ cytokine cao cấp, đặc biệt là TNF- anpha, IFN- gamma. Các cytokine này gây ra cơ chế chết tế bào và sự khác biệt trong điều trị tế bào bạch cầu .

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Dòng tế bào

Dòng tế bào ung thư máu của người, HL- 60 và U937 được sử dụng trong nghiên cứu này. Nghiên cứu trước đó được công bố bởi Tiến sĩ M.W.D William (Trung tâm nghiên cứu Ung thư Memorial Sloan-Kettering , New York, NY) và sau này được cung cấp bởi DDPC (Donal Fields, MD). Các tế bào này duy trì RPMI 1640 vừa bổ sung 10% FCS (Hyclone , Logan , UT) và thao tác cấy mô mỗi 2 hoặc 3 ngày.

Sự chia tác các tế bào đơn nhân và tế bào lympho T

Máu ngoại biên (peripheral) của người được thu thập từ những tình nguyện viên, sau đó bạch cầu được tách ra bằng cách ly tâm mật độ theo phương pháp Ficoll - Hypaque (1,077 g / ml) 400g trong 30 phút.

Tế bào đơn nhân (MNC) cho thấy sự phục hồi ở bề mặt sau khi được tái ly tâm ở RPMI trung bình1640 có chứa 10% FCS. Tế bào lympho T sau đó được tách ra từ MNC bởi rosetting với bromide amino- ethylisothiuronium ( AET ).

Sau 2 lần ly tâm mật độ và tỉ trọng, các tế bào T thu được bằng cách loại bỏ hồng cầu từ tế bào E-rosetting giảm trương lực (Patoia và cộng sự, 1987).

Bạch cầu đơn nhân được phân lập thêm từ tế bào T - được rút cạn MNC bằng cách ủ thêm ở 36°C trong 120 phút. Sau thời gian đó, tế bào lympho còn lại đã hoàn toàn được rửa sạch, tế bào monocytic sau đó được thu thập bằng cách cọ sat nhẹ với một miếng cao su (Billy Dorothy, Vineland, NJ).

Chuẩn bị PS-G - Nấm Linh Chi Đỏ

Nấm Linh Chi Đỏ được rửa sạch, và trích xuất bằng nước sôi trong vòng 8 đến 12 giờ. Hệ thống treo được lọc hoặc ly tâm để loại bỏ chất không hòa tan, và chất polysaccharide hòa tan được làm giàu được cô lập bằng ethanol trong bước thứ 2.

Các polysaccharides thô thu được sau đó thông qua phương pháp lọc gel Sephadex G50 (Pharmacel, Uppsala, Thụy Điển), được tinh chế thêm bằng cách cho trao đổi anionvowis DEAE-cellulose (Kayo và Nagakato 1983).

Để loại trừ các nội độc tố (LPS) do ô nhiễm của các mẫu PS -G Nấm Linh Chi Đỏ, trong một số thí nghiệm, phương pháp điều tiết PSG bằng cách kích thích đại thực bào của người (xem bên dưới) đã được thực hiện do sự có mặt của 5 đến 10 mg / ml polymyxin B (Sigma , WoodenB, MO ).

Ngoài ra, các đại thực bào màng bụng có C3H/HeJ trong chuột được thu thập và ủ ở 36° C trong 3 ngày có hoặc không có Nấm Linh Chi Đỏ và LPS. Các điều kiện sau đó được chuẩn bị và đánh giá đối với dịch não và tủy, sử dụng phương pháp khảo nghiệm bằng nuôi cấy vô tính của CFU - GM (Wang và cộng sự, 1992b )

Điều kiện môi trường

Để điều tra tác động của PS- G [nam linh chi] trong việc kích thích các tế bào miễn dịch sản sinh cytokine, một số lượng bạch cầu đơn nhân thuần nhất, đại thực bào (2x105/ml) và tế bào lympho T (1X106ml) được ủ riêng trong RPMI trung bình -1640 có chứa 10 % FCS có hoặc không có nồng độ (3,13-400µg mg/ml ) của PS -G [nấm Linh chi đỏ] ở 36° C trong 1-3 ngày. Các điều kiện môi trường (CM ) sau đó được thu thập, lọc và lưu trữ ở 270 ° C cho đến khi sử dụng.

Để kiểm tra các hoạt động kháng u của đại thực bào và tế bào lympho T, CM được chuẩn bị bằng cách ủ các tổng MNC (1X106/ml ) ở 36°C trong 3 ngày cùng với ( PSG- MNC -CM ) không có (MNC -CM ) của một liều tối ưu (100 µg/ml) PS -G Nấm Linh Chi Đỏ

Khảo nghiệm đối với các cytokine

Điều kiện môi trường của trường hợp không được điều trị bằng PS -G hoặc kích thích đại thực bào , tế bào lympho T có hoặc không có polymyxin B đã được khảo nghiệm cho hoạt động của IL-1b, IL-6, TNF-a and IFN-g, sử dụng phương pháp Cistran ( Cana Brook , NJ). Hệ thống (đối với IL- 1b và TNF- a) và R & D ( Minneapolis, MN ) ( cho IL- 6 và IFN- g ), gồm một enzyme liên kết khảo nghiệm immunoabsorbent pha rắn (LASSY) như mô tả của nhà sản xuất.

Điều trị tế bào bạch cầu

Dòng tế bào bạch cầu của người như HL- 60 và U937 được duy trì trong RPMI trung bình-1640 chứa 10% FCS , được lưu giữ theo cấp số nhân. Trong các thử nghiệm, các tế bào được bảo quản ở nồng độ ban đầu 1X105/ml trong đĩa Petri có hoặc không có từ 10 đến 20% (vol / vol) PSG- MNC -CM hoặc MNC -CM.

Để phát hiện các ảnh hưởng trực tiếp của PS -G Nấm Linh Chi Đỏ trên sự gia tăng các tế bào bạch cầu, một nhóm đã được điêug trị riêng với một mình PS- G ở liều lượng từ 100 đến 400 mg/ml, tương đương với 10 đến 40 lần số lượng PS- G Nấm Linh Chi Đỏ được bổ sung vào môi trường PSG- MNC -CM.

Các mẫu sau đó được ủ ở 36° C trong 5 ngày, và tế bào sống được đếm trên ngày 1 , 3 và 5 bằng cách sử dụng phương pháp thử nghiệm loại trừ của Trypan-blue. Ngoài ra, miễn dịch huỳnh quang cũng được thực hiện cho các mầu thu thập trong ngày thứ 5.

Khảo nghiệm clonogenicity

Sự tăng trưởng vô tính của tế bào HL- 60 hoặc U937 được đánh giá trong chất làm đông (Wang và cộng sự, 1992). Trong 1 khoảng thời gian ngắn, 1X103 HL- 60 U937 được cấy trong 1ml chất đông 0,3% trong RPMI trung bình 1640, chứa 15 % FCS , với nồng độ khác nhau của PS -G (50-100 mg / ml ) [nấm Linh chi đỏ], MNC -CM (5-10% , vol / vol) được thêm vào tại thời điểm mạ. Môi trường này được ủ trong 14 ngày ở 36° C trong độ ẩm có 5% CO2 ( ^ 50 tế bào ).

Trong một số thí nghiệm , các tế bào bạch cầu (1X105/ml) được trước ủ trong 12 đến 48 giờ trong các môi trườn hóa lỏng có hoặc không có PSG- MNC -CM, sau đó rửa sạch và phân tích clonogenicity trong môi trường không có phụ gia Phân tích quá trình apoptosis

DNA Hypodiploid được phân tích bằng phương pháp prodiumidid (PI) ghi nhãn và đo dòng tế bào, như mô tả của Natalie và cộng sự (1997), Chalotte và cộng sự (1993), cùng với một sửa đổi nhỏ.

Tế bào bạch cầu sau một thời gian ngắn, được điều trị hoặc không được điều trị (1,5X106) và rửa sạch, lưu trữ trong 1,5 ml dung dịch nhược trương fluorochrome ( PI 50mg/ml trong 0.1% sodium citrate và 0,1% Triton- X 100) (Sigma).

Mẫu được đặt ở 5° C trong bóng tối, và PI huỳnh quang của từng mẫu được phân tích bằng FACScan Flow cytometer (Richard Bentleman, Lincoln Park , NJ) hoặc quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Olympus AX900, Tokyo, Nhật Bản ).

Mảnh vỡ tế bào bị loại khỏi phân tích bằng cách nâng cao ngưỡng phân tán, các thành phần DNA của tế bào là intacted đươc phân tích trên quy mô lo-ga-rit.

Nhân tế bào tự hủy có chứa hypodiploid ADN phát huỳnh quang trong khoảng từ 10-400 được liệt kê theo tỷ lệ phần trăm của tổng.

DNA gel điện

Tế bào HL- 60 hoặc U937 không được điều trị PSG- MNC -CM (3X106) được hòa với 0,5 ml dung môi giải đệm [5 mM Tris –borate (pH 7,5) , 0,26 ml Matenet M- 42 (Sigma) và 1 mM EDPB], sau đs thêm RNase (Sigma) nồng độ 200 mg/ml, và ủ ở 36° C trong 2 giờ.

Các tế bào được xử lý tiếp với proteinase K (300 mg/ml) thêm 2 giờ, và AND sau đó phân lập từ tế bào lưu trữ như mô tả (Anthony và cộng sự, 1994).

Thưc hiện điện phân trên 1,5% agarose gel trong dung môi Tris-borate (pH 7,5) gồm 1 mM EDPB. DNA trong gel được nhuộm với ethidium bromide.

Xuất hiện các kháng nguyên khác biệt

Từ khi tế bào HL-60/U937 được điều trị bằng PSG- MNC - CM, xuất hiện sự lắng cặn trong quá trình ủ, xuất hiện các biểu hiện của các kháng nguyên khác biệt monocytic, CD14 và CD68, được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp huỳnh quang gián tiếp.

Hình 1 - Ảnh hưởng của PS-G [Nấm Linh Chi Đỏ] đối với việc sản sinh TNF-anpha, IL-1beta, và IL-6 của bạch cầu đơn nhân và đại thực bào. Bạch cầu đơn nhân được phân lập từ máu của người lớn bình thường được ủ ở 2X105 tế bào/ml có hay không có sự tồn tại của nồng độ PS-G 36°C trong 1 đến 3 ngày.

Các mẫu sau đó được thu thập và khảo nghiệm các hoạt động của TNF-anpha, IL-1beta, và IL-6. Dữ liệu trung bình 6 S.E.M. của 5 thí nghiệm riêng biệt.

Tế bào được thu thập từ 5 mẫu không có các chất phụ gia được điều trị bằng kháng thể dòng đơn, rửa sạch với PBS (pH 7,2), tiếp theo cho xúc tác với fluoresceinisothiocyanate (FITC) cấu trúc kháng thể thứ 2, DF(ab9) IgG (Cappel, Cochranville, PA).

Kháng thể đơn dòng chống CD14 và chống CD68 được mua từ Serotec (Oxford, Vương quốc Anh ) và Dakopatts (Glorygrup, Đan Mạch ).

Sau khi ủ, các tế bào đã được rửa sạch và quan sát dưới đèn huỳnh quang và kính hiển vi.

Kháng thể trung hòa

Tỉ lệ PSG- MNC-CM được ủ ở 36°C trong 120 phút với nồng độ khác nhau gồm các kháng thể trung hoà cytokine, bao gồm kháng IL- 1b (1200-4000 NU/ml ) và kháng IL- 6 (1000-4000 NU/ml), kháng TNF -anpha (250-1000 NU/ml) và kháng IFN- gamma (300-1000 NU/ml), được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp, PSG - MNC -CM trước khi ủ với PBS hoặc huyết thanh bình thường với vai trò xúc tác.

Sau đó chúng được thêm vào các tế bào nuôi cấy HL-60/U937 còn lại sau 5 ngày ủ . Tất cả các kháng thể cytokine trung hoà sử dụng được cung cấp bởi công ty Genzyme (Cambridge, MA).

nm_linh_chi_cha_bnh_g

KẾT QUẢ

Ảnh hưởng của PS- G (Nấm Linh Chi Đỏ) đối với việc sản sinh cytokine của đại thực bào

Tế bào lympho T và tế bào đơn nhân không phân đoạn

Hình 2 - Ảnh hưởng của PS-G đối với việc sản sinh IFN-gamma của tế bào lympho T. Tế bào lympho T được phân lập từ huyết thanh của người bình thường được ủ ở mật độ 1X106 tế bào/ml có hoặc không có nồng độ PS-G [nấm Linh chi đỏ] ở 36°C trong vòng 5 ngày, và các mẫu sau đó đã được đưa ra xét nghiệm IFN-gamma. Kết quả từ 4 thí nghiệm khác nhau cho kết quả trung bình là 6 S.E.M.

Bảng I - Hiệu quả của PS-G trong sản sinh các cytokine từ tế bào đơn nhân (PBNC)

Đại thực bào tiết ra một số tiền tố TNF-anpha (114,2+/_18,6pg/2 X 105tế bào/ml) và IL- 1beta (216,5+/- 20,8 pg/ 2 X 105 tế bào/ml). Sau khi điều trị với PS- G [nấm Linh chi đỏ], số lượng TNF-anpha và IL- 1beta tăng lên đáng kể trong các liều phụ thuộc và đạt đến đỉnh cao ở mức 100 mg/ml và 200 mg/ml, kết quả tăng rõ rệt, khoảng 9,8 lần và 5,1 lần so với các TNF anpha và IL- 1beta tương ứng. Sự sản sinh IL- 6 bởi các đại thực bào thậm chí còn mạnh hơn TOPS- Gstimulation.

Một liều nhỏ (3,13 mg / ml) PS -G đã làm gia tăng 14 lần số lượng IL- 6 và 100 mg/ml của PS -G [nấm Linh chi đỏ] tăng sản sinh IL- 6 lên 29 lần (Hình 1).

Ở trạng thái nghỉ, tế bào lympho T đã không tiết IFN- gamma, nhưng sau khi PS-G kích thích sản sinh IFN- gamma, tế bào T tăng lên rất nhiều. Đỉnh điểm là với liều PS-G 50 mg/ml, nhưng khi liều lượng này được tăng lên đến hơn 100 mg/ml, sự sản sinh IFN- gamma giảm dần (Hình 2).

Bảng 2: Phúc mạc đại thực bào (2 X 105/ml) của chuột C3H/HeJ được ủ trong 3 ngày với sự hiện hữu của nồng độ khác nhau của LPS hoặc PS-G [nấm Linh chi đỏ]. Các mẫu sau đó được thu thập và thêm vào nồng độ 10% (vol/vol) với dòng vô tính CFU-GM để khảo nghiệm hoạt động của GM-CSF. Kết quả từ 3 thí nghiệm được thể hiện là 6 S.E.M. Tỷ lệ phần trăm thay đổi đối với các kiểm soát không được điều trị.

Nếu không điều trị các tế bào đơn nhân (MNC), mà chỉ sản xuất mức độ của cytokine, bao gồm 223,4 6 21,6 pg / ml IL- 1b, 239,6+/-25,2 pg/ml IL- 6, có 89,8+/-69,7 pg/ml TNF- anpha, và 0,7+/-0,6 pg/ml IFN-gamma sau khi kích thích với PS- G [Nấm Linh Chi Đỏ], tuy nhiên, sự sản sinh các cytokine đã được gia tăng đáng kể, đặc biệt là TNF-a (12,7 lần) và IFN- gamma (189 lần) (Bảng I).

Tác động kích thích của PS -G [Nấm Linh Chi Đỏ] trên đại thực bào của người hoặc MNC không bị chặn bởi polymyxin B, vì không có sự thay đổi trong sản sinh cytokine với PS- G [nấm Linh chi đỏ](100 mg/ml ) chứa các tế bào nuôi cấy, do được thêm vào từ 5
đến 10 mg/ml polymyxin B (dữ liệu không hiển thị). Ngoài ra, điều trị đại thực bào màng bụng của chuột C3H/HeJ với PS- G [Nấm Linh Chi Đỏ] dẫn đến sự gia tăng lớn trong việc tiết GM-CSF, trong khi những đại thực bào không đáp ứng với LPS đã xuất hiện triệu chứng tràn dịch não (Bảng II)

Ảnh hưởng của PS- G và PSG- MNC -CM trên tế bào bạch cầu

Hình 3 thể hiện các động thái tăng trưởng của các tế bào HL-60/U937 dù có sự hiện hữu hay không hiện hữu của các chất phụ gia khác nhau.

Trong thời gian 5 ngày kể từ ngày ủ bệnh, số lượng các HL- 60 và U937 trong tế bào không được điều trị tăng dần từ 1 X 105/ml lên đến 3,6 X 106/ml và 2,7 X 106/ml.

Đối với tỉ lệ trung bình cộng trên tổng các mẫu,tính khả thi của cả hai dòng tế bào đã được quán ^ 98% . Không có thay đổi trong sự phát triển tế bào tại các mẫu được điều trị bằng 100 mg/ml PS-G [nấm Linh chi đỏ] (Hình 3).

Tuy nhiên, riêng PS-G [nấm Linh chi đỏ]] không có tác dụng đối với sự tăng trưởng tế bào bạch cầu ngay cả khi sử dụng liều cao hơn 400 mg/ml (Bảng III).

Hình 3 - động thái tăng trưởng của các tế bào HL-60/U937 dù có sự hiện hữu hay không hiện hữu của các chất phụ gia khác nhau.

Tế bào HL-60 và U937 được cấy ban đầu tại 1 X 105/ml/ ml và nuôi cấy trong 5 ngày ở 36° C có hoặc không có sự hiện diện của 20% CM từ PS-G (100 mg / ml) được điều trị MNC (PSG-MNC-CM) hoặc riêng PS-G [nấm Linh chi đỏ] (100 mg / ml). Tế bào sống được tính vào các ngày 1, 3 và 5.

Kết quả từ 6 thí nghiệm riêng biệt được thể hiện là 6 S.E.M (p, 0,001) so với các kiểm soát không được điều trị.

Tuy nhiên, sự phát triển của cả hai dòng tế bào bị ức chế bởi PSG-MNC-CM. Như thể hiện trong hình 3, sự khác biệt trong tế bào diệt khối u giữa PSG-MNC-CM xuất hiện vào ngày thứ 3 và trở nên rất mạnh mẽ vào ngày thứ 5 (p, 0,001). Tại thời điểm đó, nồng độ 20% (vol/vol) PSG-MNC-CM rất có thể ngăn chặn sự tăng trưởng tế bào bạch cầu, dẫn đến tỷ lệ ức chế tương ứng khoảng 70 và 75% đôi với tế bào HL-60 U937 (Bảng III, IV).

Tác dụng ức chế sự phát triển của PSG-MNC-CM ở nồng độ 10% cũng rõ ràng (p, 0,01 so với các mẫu không được điều trị), nhưng ít hơn 20% (Bảng III). Tuy nhiên, MNC-CM không có tác dụng ức chế sự tăng trưởng tế bào bạch cầu ở nồng độ tương đương (Bảng III).

BẢNG IV - Hiệu ứng trung hòa kháng thể cytokine đối với sự ức chế tăng trưởng tế bào HL-60 và U937 gây ra bởi PSG-MNC-CM

Ảnh hưởng của PS-G [nấm Linh chi đỏ] và PSG-MNC-CM trên tế bào bạch cầu

Sau 14 ngày ủ, các tế bào HL-60 và U937 được hình thành một cách tự nhiên trong các mẫu được kiểm soát, với các nhân bản của khoảng 352+/-40, 314+/-36 thuộc mỗi 1X 103 các tế bào tương ứng (Hình 4).

Nấm Linh chi đỏ cũng không có các ảnh hưởng đáng chú ý nào trên clonogenicity của các tế bà HL-60 hoặc U937. Tuy nhiên, PSG-MNC-CM ức chế rất mạnh tốc độ tăng trưởng của cả hai dòng tế bào, dẫn đến ức chế 0,90% được hình thành ở nồng độ 10% (Hình 4).

Tế bào thiệt trong ngắn hạn (12-24 giờ) trước khi ủ với PSG-MNC-CM là thấp, nhưng liên tục ủ với PSG-MNC-CM sẽ gây ra sự ức chế rất mạnh.

Ảnh hưởng của PSG-MNC-CM trên gây apoptosis với mức độ thấp (2,3 +/-0,8%) các tế bào tự hủy, đã được ghi nhận trong điều trị dòng tế bào HL-60 hoặc U937 trong thời gian 5 ngày kể từ ngày ủ bệnh, và không ghi nhận sự thay đổi đáng kể nào khi riêng PS-G Nấm Linh chi đỏ (100 mg / ml) đã được thêm vào mẫu thử, trong khi điều trị với 20% PSG-MNC-CM dẫn đến sự gia tăng rõ ràng các apoptosis phụ của cả hai dòng tế bào thử nghiệm

BẢNG III - So sánh sự ức chế tăng trưởng và sự khác biệt giữa các tế bào bạch cầu HL-60 và U937 gây ra ởi BYPS-G', PSG-MNC-CM, MNC-CM

Hình 4 - Ức chế tế bào bach cầu bởi PSG-MNCCM. Tế bào HL-60 hoặc U937 được cấy vào 1 X 103 trong 1 ml môi trường thạch có hoặc không có sự hiện diện của riêng PS-G, (N)-MNC-CM, hoặc PSG-MNC-CM.

Dung dịch được ủ trong 14 ngày ở 36° C, và sau đó ghi bàn cho thuộc địa. Dữ liệu được ghi lại từ 3 thí nghiệm khác nhau, cho ra kết quả là 6 S.E.M.

Phn_bit_nm_Linh_chi_Vit_nam

Hình 5 - Phát hiện apoptosis bằng kính hiển vi huỳnh quang, cho thấy sự xuất hiện của ethanol cố định, PI màu HL-60 (a, b) và U937 (c, d) trong nhân tế bào sau 70 giờ ủ bệnh trong môi trường (a, c) và trung bình cộng 20% PSG-MNC-CM (b, d) (bản phóng đại 10003).

Quá trình apoptosis quan sát được sự ngưng tụ nhiễm sắc thể, sự phân mảnh hạt nhân, và sự hình thành của các cơ quan tự hoại dưới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 5b , d) đồng thời cũng thể hiện như một đỉnh DNA hypodiploid trong phân tích dòng cytometric (Hình 6b,d ). Số lượng tế bào tự hủy trong HL- 60 và U937 12 giờ sau khi điều trị là 19,4+/-1,6% và 19,8 +/- 2,1%, đồng thời tăng lên 39,3+/-4,5% (HL- 60) và 43,5 6 4,8% (U937) sau 3 ngày ủ bệnh.

Ở ngày thứ 5, quá trình apoptosis ghi nhận mức gia tăng nhẹ các U937 (44,2 +/-4,2%) nhưng không tăng ở tế bào HL -60 (34,1 +/- 3,6%). Tuy nhiên , các MNC -CM (20%) không có ảnh hưởng kháng u đó. Ngoài ra, kết quả trong hình 7 chứng minh rằng sự vắng mặt hay sự hiện diện của các đỉnh DNA hypodiploid liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các ADN oligonucleosome suy thoái trong dung dịch gel điện khi các tế bào HL- 60 hoặc U937 được ủ trong môi trường có chứa 20 % PSG- MNC -CM. Các tầng lớp được thể hiện rõ hơn trong mẫu DNA thu nhận trong 48 giờ sau khi điều trị.

Ảnh hưởng của PSG- MNC -CM đối với sự phân chia các tế bào khác.

Nm_linh_chi__v_khi_u

Hình 6 - Quá trình cảm ứng apoptosis trong các dòng tế bào bạch cầu của người bằng PSG-MNC-CM. Các tế bào HL-60 (a, b) hoặc U937 (c, d) được cấy 11,5 X 106/ml và ủ trong 48 giờ ở 36° C có hoặc không có sự hiện diện của (b, d) 20% PSG-MNC-CM.

Các tế bào này sau đó được thu thập và nhuộm màu với PI. Đỉnh DNA Hypodiploid tương ứng với hạt nhân apoptosis
đã được ghi nhận bởi cytofluorometry.

Bên cạnh việc ức chế tăng trưởng, một số tế bào bạch cầu trong PSG- MNC -CM được điều trị bằng các môi trường khác nhau đã chứng tỏ sự thay đổi ở ngày thứ 3 trong 5 ngày ủ. Kiểm tra hình thái cho thấy những tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào với nhiều hình dạng và màu xám có chứa hạt và không bào (dữ liệu nhiều hơn hoặc ít hơn không được hiển thị). Hơn nữa, các tế bào tách biệt cũng thể hiện cụ thể các kháng nguyên bạch cầu đơn nhân. Như thể hiện trong Bảng III , điều trị bằng 20 % PSG- MNC -CM gây ra sự khác biệt của khoảng 45% tế bào HL- 60 và 48% tế bào U937 và các monocytesmacrophages trưởng thành thể hiện cả hai CD14 và kháng nguyên bề mặt CD68. Ngược lại, riêng PS- G (Nấm Linh Chi Đỏ) và MNC -CM không gây ra một hiệu ứng khác biệt đáng kể nào. (Bảng III).

Kháng thể trung hòa
Để xác định sự ức chế tăng trưởng các tế bào leukimia gây ra bởi PSG- MNC -CM, liên quan đến sự sản sinh các cytokine của tế bào đơn nhân được kích hoạt bởi PS_G (Nấm Linh Chi Đỏ), phần phân ước của PSG - MNC -CM được ủ với một hoặc nhiều kháng thể cytokine trung hoà, trước khi bổ sung nuôi cấy tế bào.

Bảng IV cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HL- 60 và U937 do PSG-MNC-CM là 724+/2,2% và 77,4+/-2,7%. Trung hoà với kháng IFN- gamma có vẻ đã làm giảm bớt PSG-M. Ức chế tăng trưởng MNC-CM gây ra với cả hai dòng tế bào bạch cầu, các kết quả tương tự đã được thu thập bằng cách sử dụng các kháng TNF-a (Bảng IV). Tuy nhiên, kháng IL-1b hoặc kháng IL-6 không có tác dụng này.

Nm_Linh_chi__v_t_bo_ung_th

Hai kháng thể được sử dụng cùng với nhau do (p, 0,001) ngăn chặn các kêt quả ghi nhận sự kết hợp của kháng TNF-a và kháng IFN-g, trong đó giảm tỷ lệ ức chế từ 72-77% (trước khi trung hòa) xuống còn 12 đến 18%, trong khi đó kết hợp 2 kháng thể không hiệu quả khác (Bảng IV). Trong số 3 kết hợp kháng thể, duy nhất kháng TNF-anpha, kháng IFN-gamma và kháng IL-1b gia tăng các hoạt động ngăn chặn. Trong nghiên cứu bảng này, trung hòa hoàn toàn PSG-MNC-CM gây ra ức chế đã không đạt được bởi các kháng thể cytokine sử dụng ở trên

Hình 7 - Gel điện di mẫu DNA được cô lập từ tế bào HL-60 và U937 sau khi ủ ở 36° C trong 48 giờ có hoặc hông có PSG-MNC-CM. Đường B, đường đơn trung bình; đường C, 20% MNC-CM; đường D, 20% PSG-MNC-CM.

Chất Polysaccharides kháng ung thư đã được ghi nhận từ một vài nguồn thực vật trong tự nhiên, bao gồm cả thực vật bậc cao, nấm Linh chi đỏ và vi khuẩn. Trong số đó, polysaccharides chống khối u từ nấm Linh chi đỏ là hiệu quả nhất do không có các tác dụng phụ và ảnh hưởng tiêu cực đến các tế bào khỏe mạnh khác. (Nagaka, 1988; Sheng và các cộng sự, 1992). Lentinan từ Lentinus

edodes (Wil.) Patrick. (Kamato và cộng sự , 1987) , PS-K/PS-P Coriolusben (Mizushima và cộng sự, 1985; Sheng và các cộng sự , 1993) và PS- G từ Nấm Linh chi đỏ (Andrew và cộng sự, 1989; Kayo và cộng sự, 1991) 3 polysaccharides quan trọng trong nấm linh chi đỏ đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u. Trong nghiên cứu này, PS- G được phân lập là các polysaccharide protein huyết tương bao gồm khoảng 97% polysaccharides và 6 % peptide, các quan sát hiệu ứng đại thực bào, tác dụng kích thích của PS -G không phải do nội độc tố (LPS), các hiệu ứng ảnh hưởng lên các đại thực bào từ LPS kháng C3H/HeJ ở chuột (Bảng II) không bị ngăn chặn bằng cách bổ sung mẫu PSG chứa polymyxin B, là một chất ức chế cụ thể và mạnh của LPS (Federicque và cộng sự,1988; Shiva và cộng sự, 1987). Cơ cấu cần thiết cho việc chống khối u do tăng cường hoạt động của PS- G đã được ghi nhận là một nhánh glucan liên quan đến liên kết (1-3)- b - (1-4) - b - và (1-8 )- b ( Tanaka và Seiko, 1983; Shen và cộng sự , 1995). Thụ thể b - glucan trên tế bào monocytic, trong đó bao gồm 2 liên kết protein disulfide với trọng lượng phân tử 180 và 160 kDa và có chung một 20 - kDa polypeptide với các mã epitope, đã được ghi nhận chức năng thực bào (Kayo và Lanos, 1993).

Mặc dù nghiên cứu thực nghiệm đã nhiều lần thể hiện nấm linh chi đỏ có khả năng ngăn chặn sự phát triển khối u trong cơ thể (Sophia và cộng sự, 1987; Kayo và cộng sự, 1991; Shen và cộng sự, 1988).
hành động của nấm Linh chi đỏ cho đến nay vẫn chưa được làm rõ. Nhiều nhà nghiên cứu đã cho rằng các tác dụng chống ung thư của PS- G [nấm Linh chi đỏ] có thể thông qua trung gian là hệ miễn dịch. Tuy nhiên, một suy luận cần thiết hơn nếu kèm theo những bằng chứng đáng kể. Trong nghiên cứu này, kết quả của chúng tôi chứng minh rõ mối quan hệ tương hỗ chặt chẽ giữa các hiệu ứng miễn dịch và các hoạt động chống khối u của PS- G [nấm Linh chi đỏ]. Đầu tiên, PS- G nấm linh chi đỏ có tác dụng kích thích mạnh mẽ cả trên các đại thực bào và tế bào lympho T trong quá trình thúc đẩy tổng hợp và giải phóng các cytokine khác nhau, bao gồm cả IL- 1beta , IL-6 , TNF -anpha và IFN- gamma, được biết đến với vai trò quan trọng trong việc điều tiết phản ứng miễn dịch và ức chế sự phát triển các tế bào ung thư (Kazan, 1988; Dean và cộng sự , 1992a; Dinarello năm 1989; Dorothy và cộng sự, 1996). Ngoài ra, chính bản thân PS- G không có các hoạt động kháng u trực tiếp, ngay cả ở liều cao hơn 400 mg/ml (Bảng III), nhưng các tương tác từ các tế bào đơn nhân PSG kích hoạt (PSG- MNC -CM ) chống tăng sinh. Cả hai dòng tế bào HL- 60 và U937 có thể bị ức chế bởi PSG- MNC -CM ở mức thấp (15%), chỉ chứa khoảng 10 mg/ml của PS - G. Bên cạnh đó, đại thực bào không được điều trị và tế bào lympho T sản sinh ít hoặc không sản sinh
cytokine và MNC -CM không ức chế tăng trưởng tế bào bạch cầu, hoạt động chống khối u của PS- G rõ ràng là do kích hoạt các đại thực bào và tế bào lympho T, dẫn đến thúc đẩy giải phóng cytokine.

Nghiên cứu trung hòa kháng thể cho thấy cytokine kháng u trong PSG- MNC -CM chủ yếu là TNF-anpha và IFN- gamma. Kháng TNF - AOR vô hiệu hóa khoảng 35 đến 40% tăng trưởng PSG- MNC -CM, trong khi kháng TNF-anpha cùng kháng IFN- gamma dẫn đến trung hòa từ 70 đến 85%. Điều này chứng tor rằng TNF-anpha và IFN-gamma cùng có tác dụng ứcc chế tăng trưởng tế bào bạch cầu. Những ảnh hưởng của sự đồng bộ giữa TNF-a và IFN-g cũng liên quan chặt chẽ tới các phản ứng khác của loại khối u di căn, ví dụ, ức chế sự tăng trưởng khối u ác tính của chuôt (Levi và cộng sự. , 1985) và của dòng ung thư vú xenografts của người hoặc ung thư ruột (Natalie 1987). Hơn nữa, kết quả của chúng tôi cho thấy có một mối tương quan tích cực giữa tác động của TNF -a và IFN- g trong việc kích hoạt các cảm ứng tiêu diệt tế bào ung thư của các tế bào bạch cầu HL- 60 và U937.

Mức PSG- MNC -CM cao của IL- 1b và / hoặc IL- 6 dường như là không gây độc tế bào đối với HL- 60 và U937 trong ống nghiệm (Bảng IV ).

Tuy nhiên , kết quả này không loại trừ khả năng rằng tăng IL -1 và IL -6 có thể đóng một vai trò gián tiếp trong việc gây miễn dịch chống khối u trong cơ thể. Ví dụ , IL -1 có thể hoạt động như một
mã phản hồi để kích thích đại thực bào tiết ra TNF-a (Andrew, 1994), và IL -1 kết hợp với IL- 6 có thể cùng nhau kích hoạt các tế bào T và gia tăng sản sinh IL-2 (Kayo, 1992). Tuy nhiên ,
IL -1 và IL- 2 có thể phối hợp hiệu quả để thúc đẩy sự sinh sản IFN-g (Federique và Antonio - FD, 1992). Tất cả các cytokine được biết đến với chức năng tham gia vào hệ miễn dịch trong cơ thể.

LỜI CẢM ƠN

Công trình này được hỗ trợ bởi KDS 83-B730-001 từ Hội đồng Khoa học Quốc gia Đài Loan

NGUỒN THAM KHẢO

Wang DW. Cập nhật từ châu Á. Nghiên cứu châu Á trên chemoprevention ung thư. Ann N Y Acad Khoa học . 1999; 889:157-192

Shiao MS , Lee KR , Lin LJ , Wang CT . Hoạt động sinh học của nấm y tế Trung Quốc , nấm Linh chi sản phẩm tự nhiên. Trong : Ho CT , Osawa T , Huang MT , Rosen biên tập RT.

Phytochemicals thực phẩm phòng chống ung thư . II. Các loại trà, các loại gia vị và thảo dược. Washington, DC: Hội Hóa học Mỹ , 1994 , p . 342-354

Sliva D. Các hiệu ứng dược tính của nấm Linh chi. Mini- Rev Med Chem . 2004; 4:873-879

Eisenberg DM , Davis RB , Ettner SL , Appel S , Wilkey S, Rompay M, et al . Xu hướng sử dụng thuốc thay thế tại Hoa Kỳ, 1990-1997 : Kết quả của một cuộc khảo sát quốc gia tiếp theo. JAMA .

Min BS , Gao JJ , Nakamura N , Hattori M. Triterpenes từ các bào tử của nấm Linh chi và độc tế bào chống lại meth -A và các tế bào khối u LLC .

Miyazaki T , Nishijima M. Các nghiên cứu về polysaccharides nấm. XXVII . Kiểm tra cấu trúc của một hòa tan trong nước , polysaccharide kháng u của Nấm Linh chi đỏ. Chem Pharmacol Bull . 1981; 29:3611-3616

Sone Y , Okuda R , Wada N , Kishida E , Misaki A. Cấu trúc và hoạt động kháng u của polysaccharides phân lập từ cơ thể đậu quả và văn hóa ngày càng tăng của sợi nấm của nấm Linh chi. Agric Biol Chem . 1985; 49:2641-2653

Fu -sheng Zhang , Ya -li Lv , Yue Zhao , Shun - xing Guo. Phát huy vai trò của một endophyte trên sự tăng trưởng và nội dung của kinsenosides và flavonoid của Anoectochilus formosanus Hayata , hiếm và bị đe dọa cây Orchidaceae thuốc . Tạp chí Đại học Chiết Giang KHOA HỌC B 14:09 , 785-792.

Natthakarn Chiranthanut , Supanimit Teekachunhatean , Ampai Panthong , Parirat Khonsung , Duangta Kanjanapothi , Nirush Lertprasertsuk. Đánh giá độc tính của chiết xuất tiêu chuẩn hóa của Gynostemma pentaphyllum Makino . Tạp chí Ethnopharmacology 149:1 , 228-234.

Nguồn: sưu tầm

Nguồn: Sưu tầm

Các tin khác :

Sản phẩm nổi bật

Nấm Linh Chi Fuji Đỏ nguyên tai 500g

Giá : 1,980,000 đ

Giá KM : 1,249,000 đ